转录激活因子样效应物核酸酶介导的山羊β-乳球蛋白基因敲除和人乳铁蛋白基因定点整合

为了敲除山羊乳中致敏源β-乳球蛋白 (BLG) 基因，同时在BLG基因座定点整合人乳铁蛋白 (hLF) 基因。首先针对山羊BLG第3外显子识别位点设计了1对特异性TALEN-3-L/R质粒对；同时，构建了含有1个HSV-TK负筛选基因的hLF基因打靶载体BLC14-TK。TALENs质粒对转染山羊胎儿成纤维细胞，2 μg/mL嘌呤霉素筛选3 d，PCR扩增产物测序来验证其切割DNA活性。打靶载体BLC14-TK与TALEN-3-L/R质粒对共转染山羊胎儿成纤维细胞，经700 μg/mL G418 和2 μg/mL GCV共筛选药物抗性细胞株；通过整合检测和同源重组检测来筛选hLF基因打靶细胞株；BLG–/hLF+打靶细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植。结果为：TALEN-3-L/R致突变率为25%?30%；获得BLG–/hLF+打靶细胞6株；共制作重构胚胎335枚，移植受体山羊23只，B超检测到30?35 d的妊娠受体9只 (妊娠率39.1%)，其中1只50日龄克隆胎儿验证为BLG-/hLF+基因型。以上结果表明获得BLG基因座定点整合hLF基因的基因打靶山羊是可行的，为培育羊乳中含低致敏原和富含hLF的山羊新品系奠定了基础