米根霉α-淀粉酶热稳定性的理性设计

真菌α-淀粉酶被广泛应用于麦芽糖浆生产工业，但其热稳定性普遍较差，在制糖工艺中增加了由于酶活力损失而引起的追加生产成本。在充分研究了热稳定性对于真菌α-淀粉酶应用于工业生产的重要性的基础上，为提高米根霉α-淀粉酶 (ROAmy) 的热稳定性，基于酶蛋白B-factor分析和分子动力学模拟，利用重叠PCR技术分别对ROAmy中的3个氨基酸残基G128、K269和G393进行了单点突变及组合突变。结果表明，所获得的7个突变体均比原酶具有更好的热稳定性，其中效果最好的为组合突变体G128L/K269L/G393P，其在55 ℃下的热失活半衰期 (t1/2) 约为原酶的5.63倍。同时，该突变体的最适温度由50 ℃提高到了65 ℃，最大反应速率 (Vmax) 和催化效率 (kcat/Km) 分别提高了65.38%和99.86%。通过蛋白结构功能比较分析，发现氢键数目的增多或脯氨酸在特殊位置中的引入可能是突变体热稳定性得到提高的主要因素