反刍兽月形单胞菌β-木糖苷酶基因在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

β-木糖苷酶 (β-xylosidase，酶编号EC 3.2.1.37) 是木聚糖降解酶系中的重要组成部分。本研究以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主菌尝试表达反刍兽月形单胞菌Selenomonas ruminantium中的β-木糖苷酶基因Sxa。根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、mRNA二级结构、GC含量和稀有密码子，对Sxa基因进行优化；通过基因合成技术获得了全长基因mSxa并构建重组酵母表达载体pPIC9K-mSxa；以Bgl Ⅱ酶切重组载体pPIC9K-mSxa，电击转化将mSxa基因导入毕赤酵母GS115中，获得的转化子经过表型和遗传霉素G418抗性筛选、PCR鉴定，得到表达β-木糖苷酶基因的工程菌GS115-pPIC9K-mSxa；通过活性测定获得高效表达β-木糖苷酶的重组酵母，并对重组β-木糖苷酶的酶学性质进行了初步研究。结果表明，重组β-木糖苷酶的分子量约为66 kDa。在发酵罐水平表达的酶活性达到了287.61 IU/mL。对酶学性质研究显示，该酶在温度为40?60 ℃，pH为5.0?7.0时较稳定，其最适反应温度和pH分别为55 ℃和6.0，专一性地作用于β-木糖苷键。Mn2+和Ca2+对该酶具有激活作用，而Fe3+、Cu2+、Co2+、Mg2+、EDTA及SDS抑制其酶活性。本研究首次将反刍兽月形单胞菌的β-木糖苷酶基因转化到毕赤酵母中获得表达，并具有较高活性，为进一步工业化应用奠定了基础