GST-SOD1-R9融合蛋白的表达、纯化、稳定性与跨膜效应

穿膜肽TAT介导的双效抗氧化酶GST (谷胱甘肽巯基转移酶)-TAT-SOD1 (Cu, Zn 超氧化物歧化酶)，可有效清除胞内自由基，其预防氧化损伤的效果强于SOD1-TAT，但前者的跨膜能力不如后者。为增强双效抗氧化酶的跨膜效率，本研究融合了SOD1和穿膜肽R9，合成SOD1-R9全基因序列，并将其插入带有GST的原核表达载体pGEX-4T-1中，成功构建了GST-SOD1-R9融合蛋白表达质粒。然后，将重组质粒pGEX-4T-1-SOD1-R9转化大肠杆菌BL21 (DE3)，用IPTG诱导表达融合蛋白，通过改变诱导温度和诱导时间，确定了融合蛋白在25 ℃下表达11 h，可得到高表达量的可溶性GST-SOD1-R9融合蛋白。利用80%硫酸铵沉淀和GST琼脂糖珠纯化得到纯蛋白，应用SDS-PAGE和酶活性鉴定纯化的蛋白为正确表达的目标蛋白。GST-SOD1-R9融合蛋白的温度和pH稳定性实验结果证实，该蛋白在生理条件下具有良好的SOD和GST活性。细胞跨膜实验结果证明其跨膜能力与GST-TAT-SOD1融合蛋白相比显著增强 (P<0.05)。这些工作为深入研究GST-SOD1-R9的抗氧化损伤效应建立了基础