基于微滴式数字PCR检测肠癌病人游离环状DNA KRAS突变的新方法

基于微滴式数字聚合酶链式反应 (Droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR) 设计一种检测肠癌游离循环DNA (Circulating cell free DNA, cfDNA) 中 KRAS (V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog) 基因突变的新方法并评估其灵敏度和准确性。根据肠癌病人KRAS基因的突变类型设计并合成，采用ddPCR扩增并评估其灵敏度和准确性；根据AMRS-PCR引物设计原理设计KRAS基因的实时定量PCR扩增引物并评估其准确性，进而比较ddPCR和qPCR二者之间的优缺点；最后针对52例肠癌病人的cfDNA采用ddPCR进行检测，研究ddPCR在cfDNA KRAS基因突变检测的应用。成功使用ddPCR和qPCR两种方法对KRAS野生型及7种突变型建立检测方法，使用质粒标准品及实际样品验证该两种方法可行并对其假阳性率、线性范围及检测下限等性能进行了评价，最后成功对52例临床患者和20例正常人的血浆cfDNA样本进行检测，临床灵敏度为97.64%，临床特异性为81.43%。ddPCR的检测性能优于qPCR，LOD达到个位数DNA拷贝，最低可确认突变浓度达到0.01%–0.04%。样本提取效率在方法学建立中也十分重要，直接影响到灵敏度和Cut Off值的判定。临床患者检测结果显示其KRAS突变率接近报道水平