利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株

基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2 (Homo sapiens dynein, axonemal, heavy chain 2) 基因敲除的U2OS稳定细胞株，旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sgRNA (Single guide RNA) 以及各自的互补链，退火连接形成DNAH2 sgRNA-A、B双链，再分别与带有BbsⅠ粘性末端的pX462线性载体相连，形成pX462-DNAH2-A、pX462-DNAH2-B重组真核表达质粒。质粒共转染至U2OS细胞后，加入嘌呤霉素，以有限稀释法获得阳性单克隆细胞株，再以蛋白印迹实验检测DNAH2蛋白的表达，最后通过PCR-基因测序技术分析突变特点。结果显示A、B sgRNA双链成功插入pX462载体，U2OS-DNAH2-KO单克隆细胞株中DNAH2蛋白不表达，DNAH2基因发生移码突变，从而证实利用CRISPR/Cas9n double nick系统成功构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株，为研究DNAH2基因提供有利工具