通过番茄红素环化酶的优化构建β-胡萝卜素高产菌株

目标产物的合成途径往往需要对关键酶的来源、表达水平等因素进行系统性优化才能实现代谢通量的最大化。β-胡萝卜素是一类具有重要应用价值的萜类化合物，其中番茄红素环化酶 (Lycopene cyclase，CrtY)是β-胡萝卜素合成途径中的关键酶，能够催化FAD依赖的环化反应将番茄红素转化合成β-胡萝卜素。本研究通过对CrtY的系统优化提高β-胡萝卜素的合成水平，并确定CrtY的表达对代谢通路的影响。在大肠杆菌中以番茄红素合成模块为基础，通过引入番茄红素环化酶基因crtY构建了β-胡萝卜素合成模块。并进一步利用寡聚接头介导的DNA组装方法 (Oligo-linker mediated assembly method，OLMA) 引入一系列不同强度的人工设计的核糖体结合位点 (Ribosome-binding site，RBS)，对CrtY的表达强度、基因来源等因素进行高通量的优化。通过OLMA文库构建和平板筛选，获得了5株高产β-胡萝卜素的工程菌株。在摇瓶中，5株工程菌株的β-胡萝卜素产量可达15.79?18.90 mg/g DCW (Dry cell weight)，比优化前提高了65%。进一步选取了其中的CP12菌株，在5 L发酵罐上，利用高密度培养技术验证工程菌株合成β-胡萝卜素的能力。最终β-胡萝卜素产量可达1.9 g/L。RBS强度分析及代谢中间体分析表明，适当地降低CrtY表达强度能够有利于β-胡萝卜素模块相关基因之间协同发挥作用。以上结果为β-胡萝卜素合成途径的优化规律提供了理论指导