酶切法去除荧光定量聚合酶链反应体系中内源性核酸污染

目的建立去除荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）体系中内源性核酸污染的方法，用于降低或排除颅内术后易感染细菌的荧光定量 PCR 检测出假阳性的概率。 方法首先去除荧光定量 PCR 反应体系中的内源性核酸污染；随后利用多重 PCR 技术，以混合菌 DNA 作为模板进行革兰菌特异性鉴定；并研究去除污染后的多重 PCR 技术检测混合细菌 DNA 的检测限和灵敏度。 结果建立的方法能够快速有效地去除荧光定量 PCR 体系内的内源性核酸污染，并对 PCR 体系中 Taq 酶的活性以及扩增效率均无影响，最低检测限为 10 2 CFU/mL（金黄色葡萄球菌和绿脓假单胞菌），与培养法相同。酶切法对 PCR 体系中酶的活性及扩增效率均无明显影响，且对 PCR 反应体系及引物特异性没有影响（循环数 Ct=32，荧光强度 ΔRn=200）。过滤法却使 PCR 扩增效率显著下降（循环数 Ct=32，荧光强度 ΔRn=150）。 结论酶切法去除内源性核酸污染对荧光定量 PCR 检测限及灵敏度均无影响，操作简便快速，降低了 PCR 检测的假阳性概率，能及时准确地诊断颅内细菌感染