TGF-β1 联合 VEGF 对人羊膜间充质干细胞向韧带成纤维细胞体外分化作用的研究

目的 探讨人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）是否具有 MSCs 特性，以及经 TGF-β1 和 VEGF 联合诱导后是否具有向韧带成纤维细胞分化的能力。 方法 取自愿捐赠的足月产妇胎盘，采用胰蛋白酶胶原酶联合消化法分离培养 hAMSCs，流式细胞术检测 hAMSCs 表型分子，免疫荧光染色检测 hAMSCs 其角蛋白-19（cytokeratin-19，CK-19）和波形蛋白表达情况。取第 3 代 hAMSCs，分别使用含 TGF-β1 和 VEGF 的 L-DMEM/F12 成韧带或纤维细胞诱导培养基（实验组）和普通 L-DMEM/F12 培养基（对照组）培养，细胞增殖-毒性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）检测两组细胞增殖能力；培养 5、10、15 d 分别采用免疫荧光染色及实时荧光定量 PCR 检测韧带及血管生成相关特异性蛋白和基因表达。 结果 倒置相差显微镜观察示 hAMSCs 呈单层贴壁生长；流式细胞术结果示 hAMSCs 表达 MSCs 表型分子；免疫荧光染色示 hAMSCs 高表达波形蛋白、低表达 CK-19；hAMSCs 具有向成骨、成软骨及成脂细胞分化的能力。CCK-8 法检测示，7 d 时两组细胞均达增殖高峰，实验组细胞增殖能力于 7 d 后显著高于对照组（P<0.05）。免疫荧光染色示，培养 5、10、15 d 时实验组 Ⅰ 型胶原、Ⅲ 型胶原、纤维连接蛋白（Fibronectin）、细胞连接素（Tenascin-C）表达染色均较对照组增强。实时荧光定量 PCR 结果示，随时间延长实验组 Ⅰ 型胶原、Ⅲ 型胶原、Fibronectin、α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、VEGF mRNA 相对表达量均逐渐上调（P<0.05）。除培养 5 d 两组 Ⅰ 型胶原、Ⅲ 型胶原、VEGF mRNA 相对表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点实验组 Ⅰ 型胶原、Ⅲ 型胶原、Fibronectin、α-SMA 和 VEGF mRNA 相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。 结论 hAMSCs 具有 MSCs 特征，且体外增殖能力良好，可作为组织工程种子细胞来源；体外诱导后韧带成纤维细胞及血管生成相关特异性基因表达上调，韧带成纤维细胞特异性蛋白分泌增加，TGF-β1 联合 VEGF 可作为构建组织工程韧带的生长因子选择