壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤的实验研究

目的探讨壳聚糖多孔支架复合 BMSCs 移植修复大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的可行性。方法取成年 SD 大鼠胫骨及股骨骨髓，采用全骨髓贴壁培养法分离培养 BMSCs，并传代。取第 3 代细胞行表面抗原 CD29、CD45 鉴定及 BrdU 标记。采用冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架，并与 BrdU 标记的第 3 代 BMSCs 进行体外共培养；扫描电镜观察细胞黏附情况，MTT 法检测支架内细胞生长情况。取 50 只成年 SD 大鼠，随机分为 A、B、C、D、E 组（n=10）。A～D 组大鼠采用 Feeney 自由落体打击致伤原理制备 TBI 模型，造模后 72 h 分别移植 BMSCs-壳聚糖多孔支架复合体、BMSCs、壳聚糖多孔支架和完全培养基；E 组为假手术组。于造模前及造模后 1、7、14、35 d，各组大鼠行改良神经功能缺损评分（modified neurological severity scores，mNSS）；造模后进行 Morris 水迷宫测验，包括定位航行测验（造模后 31～35 d 连续 5 d 检测潜伏期）及空间探索测验（造模后 35 d 检测穿越平台次数）；造模后 36 d 取标本行 HE 染色、BrdU 与高分子量神经丝蛋白免疫组织化学双重染色以及 BrdU 与神经胶质酸性蛋白免疫组织化学双重染色，观察大鼠脑损伤区 BMSCs 的迁移与分化情况。结果流式细胞仪检测示第 3 代 BMSCs 的 CD29 阳性率为 98.49%，CD45 阳性率仅为 0.85%；扫描电镜示支架-细胞共培养 48 h 后，BMSCs 呈梭形并分泌细胞外基质黏附于支架上；MTT 法检测示壳聚糖多孔支架对 BMSCs 的增殖分化无不良影响。TBI 造模后 35 d，A 组大鼠 mNSS 评分、定位航行测验的潜伏期显著低于 B、C、D 组，空间探索测验的穿越平台次数显著高于 B、C、D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、E 组间上述指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。HE 染色示 A 组壳聚糖多孔支架已部分降解，其与脑组织融合良好，修复程度优于 B、C、D 组。免疫组织化学双重染色结果示，A 组移植的 BMSCs 存活、分化为神经元和神经胶质细胞，并迁移至正常脑组织内，修复程度优于 B、C、D 组。结论壳聚糖多孔支架介导的 BMSCs 移植能够明显改善大鼠 TBI 后的神经功能，亦能抑制大鼠脑损伤区胶质瘢痕形成，并可使 BMSCs 在脑损伤区存活、增殖和分化为神经细胞