体外长期培养的猪 BMSCs 发生转化过程中基因表达谱和 DNA 甲基化谱关联分析

目的 探讨体外长期培养的长白猪 BMSCs 全基因组 DNA 甲基化状态，阐明甲基化在调节基因表达上与 BMSCs 发生转化的关系。 方法 抽取 3 月龄长白猪胫骨近端骨髓，采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对 BMSCs 进行分离、纯化、体外传代培养。细胞恶性转化通过细胞形态、核型分析、双层软琼脂克隆形成实验、血清依赖性实验以及裸鼠成瘤实验进行验证。使用定制的家猪甲基化芯片和 Agilent 全基因组表达谱芯片，通过生物信息学分析获得第 2 代和第 25 代 BMSCs 全基因组甲基化表达水平和 mRNA 表达谱，并进行 mRNA-甲基化的关联分析，筛选 DNA 异常甲基化谱，同时对这些基因进行 KEGG 富集分析。 结果 长期培养的 BMSCs 逐渐表现出转化细胞的特性：由较大的纺锤形逐渐变为小的梭形，血清依赖程度显著降低，在双层软琼脂培养基中锚着独立生长并形成细胞集落，在裸鼠体内形成肿瘤组织。全基因表达谱芯片筛选出转化过程中上调表达的 257 条基因和下调表达的 315 条基因，信号通路分析发现部分细胞周期相关基因表达上调，部分细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）、黏着斑通路（focal adhesion）、肌动蛋白细胞骨架调节（regulation of actin cytoskeleton）、癌症通路（pathways in cancer）、P53 等通路相关基因表达下调。DNA 甲基化芯片分析得到受甲基化调控的 962 条差异基因和 1 219 条受去甲基化的基因，并发现这些基因主要参与细胞代谢、增殖分化、细胞结构、炎性免疫、肿瘤发生等生物过程。联合分析 BMSCs 转化过程受甲基化调控的基因，发现 35 个基因的甲基化改变与表达变化方向相反（相关系数 r=–0.686，P=0.000），其中 21 个基因启动子区甲基化程度升高而基因表达下降，14 个基因启动子区甲基化程度下降而基因表达升高；同时 KEGG 富集分析发现多个受甲基化调控、参与干细胞分化的基因及参与的多个细胞信号通路，其中在 14 条甲基化下调而表达上调的基因中，很多具有调节肿瘤发生与免疫炎性相互平衡的作用，其中 CDKN3 启动子区甲基化状态改变可能与细胞肿瘤化密切相关。 结论 研究结果表明甲基化参与猪 BMSCs 自发转化，这为 BMSCs 临床应用预警和防止转化提供了新线索