应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定

摘要 以牙鲆空通气孔同源框2基因(empty spiracles homeobox 2，emx2)为例，构建包含emx2 3'UTR区的野生型和突变型双荧光素酶重组报告表达载体，以期应用于miRNA靶标的检测。利用Trizol 法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总 RNA，参照已克隆出来的 emx2 基因cDNA 序列，设计并合成 emx2 3'UTR片段的引物并进行 PCR 扩增，将得到的基因片段和 psiCHECK-2 载体双酶切后，用T4 DNA Ligase 酶进行连接反应，并转化入 DH5α 感受态细胞，筛选后得到野生型重组质粒；同时采用定点诱变法对emx2基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。成功克隆了emx2 3'UTR区，并将emx2 3'UTR区的miRNA靶点序列GACTTGA突变为 AGTCCAG，成功构建了野生型和突变型包含emx2 3'UTR区的miRNA靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于miRNA靶标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体 psiCHECK-emx2-3'UTR 和 psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR