一种改进后的重叠延伸PCR法对被孢霉重组载体的构建

摘要 为了提高DNA大片段的拼接效率，通过引入逐次退火的PCR的方法，改良了传统的重叠延伸PCR方法。逐次退火PCR法，一方面延长了重叠区的PCR引物长度；另一方面把原来在1个循环中1个退火温度改成若干个，逐次降低退火温度，适用于Tm值相差比较大的引物；相邻的退火温度之间相差3-6℃。结果显示，通过此种方法成功拼接了ω3（2）和HCT两个大片段；PCR产物电泳条带单一，克隆测序证实序列完全正确，可以直接应用于后续试验。这种改进后的方法可以有效减少非特异性扩增，提高灵敏度，把这种方法称之为逐次退火重叠延伸PCR