筛选dbat启动子顺式元件结合蛋白的酵母单杂交文库的构建

摘要 旨在构建酵母单杂交文库用于筛选与dbat基因启动子顺式元件结合的转录因子。首先,分离dbat启动子上的顺式作用元件,并进行3个拷贝的重复后,和报告质粒pHis 2.1连接构建诱饵载体pHis 2.1-dp3。然后,从茉莉酸甲酯诱导的红豆杉细胞中提取总RNA,以纯化出的mRNA为模板,依次完成ss cDNA和ds cDNA的合成,并将纯化的ds cDNA、线性化载体pGADT7-Rec2和诱饵载体pHis 2.1-dp3共转化酵母细胞Y187,各取100μl分别涂布于SD/-leu和SD/-leu/-trp平板,用于计算重组效率和转化效率,剩余转化液涂布于SD/-leu/-trp/-his/20 mM3-AT平板,用于筛选阳性克隆。结果表明,重组效率为1.49×106CFU/μg,共转化效率为1.93×105CFU/μg;对阳性克隆质粒进行酶切、测序分析,得到6个可编码结合蛋白的基因。以上工作为筛选调控紫杉醇合成关键酶基因dbat表达的转录因子奠定了基础