人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测

摘要 旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表达系统。从HeLa细胞中提取总的RNA，通过RT-PCR获得Csk基因全长cDNA序列，并将其克隆至真核表达载体pENTER中，构建重组质粒pENTER-Csk-his。重组质粒转染293T细胞48 h后通过SDS-PAGE、Western blot检测Csk蛋白表达情况，间接免疫荧光进行蛋白定位，通过镍螯合的磁珠法纯化Csk蛋白，his-pulldown及CO-IP检测表达蛋白的活性。结果显示，经双酶切及测序鉴定，真核表达载体pENTER-Csk-his正确没有突变，SDS-PAGE及Western blot均可检测到大小约为51 kD的目的蛋白，说明Csk蛋白在293T细胞中表达成功，间接免疫荧光定位重组Csk蛋白在细胞质中表达，通过磁珠纯化得到Csk蛋白，最后通过his-pulldown及CO-IP发现Csk能够与IGF1R、SHC1相互作用，说明表达的Csk蛋白具有生物学活性。成功获得Csk基因全长序列，并构建重组pENTER-Csk-his真核表达质粒，在真核细胞293T的细胞质中获得高效表达且表达的蛋白具有生物学活性