小鼠RHOX5蛋白两种截短型突变体的原核表达及其与MDFIC互作的鉴定

目的：表达和纯化两种小鼠RHOX5蛋白的截短型突变体，确定完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。方法：生物信息学分析小鼠同源异型框蛋白RHOX5的cDNA序列，分别对RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C进行PCR、分别扩增RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C并将其克隆至pGEX4T3原核表达载体，构建重组表达质粒。用重组表达质粒分别转化大肠杆菌RosettaTM2(DE3)菌株，经IPTG诱导后，使用Glutathione-Sepherase 4B颗粒对融合蛋白进行小批量亲和纯化，通过SDS-PAGE电泳分离目标蛋白，确定融合蛋白的表达。进行GST-pull down实验，检测完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。 结果：在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中有效地实现了GST-RHOX5、GST-RHOX5 N和GST-RHOX5-C-3种融合蛋白的可溶性表达；经Glutathione Sepherase 4B颗粒亲和纯化后，获得了纯化后GST融合蛋白；GST-pull down实验证实，含有homeodomain的RHOX5蛋白和RHOX5C截短型突变体可以与MDFIC蛋白相结合，而RHOX5N截短型突变体则丧失了与MDFIC蛋白结合的能力。 结论：实现了RHOX5及其两种截短型突变体的原核表达和纯化，证实RHOX5蛋白的homeodomain结构域是其与MDFIC结合的关键部位