人源TNFα的原核表达及活性测定

目的：利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体，通过表达及纯化获得重组蛋白，为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法：利用PCR技术，从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列，并在其上游添加SUMO标签，与原核表达载体pET28a连接，构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21（DE3）工程菌中表达融合蛋白，经Ni-NTA 纯化体系纯化，切除SUMO标签，纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性，以测定TNFα的生物学活性。结果：成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒，酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21（DE3）工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8 μg/ml。结论：成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα，经表达、纯化、酶切及再纯化，获得有生物活性的hTNFα蛋白，为深入研究和利用hTNFα奠定基础