人ANKRD49基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究和RNA干扰靶点的鉴定

目的: 克隆人ANKRD49基因并构建其真核表达重组体,利用构建成功的ANKRD49真核表达重组体对其进行功能的初步研究,并筛选和鉴定其RNA干扰靶点. 方法: 提取人肺腺癌细胞株A549总RNA,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对ANKRD49进行扩增,扩增产物与真核表达载体p3×Flag-CMV-14同时进行双酶切,酶切产物连接后转化入感受态细胞Top10,阳性重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法(LipofectamineTM 2000)转染人胚肾细胞(HEK 293T),免疫印迹(Immunoblotting)和免疫荧光技术检测表达产物.免疫荧光法检测ANKRD49在宿主细胞内的定位.MTT法检测ANKRD49对宿主细胞的增殖作用.设计并合成针对人ANKRD49基因的RNA干扰靶点序列,与p3×Flag-CMV-14/ANKRD49共转染HEK 293T细胞后,Immunoblotting鉴定ANKRD49的RNA干扰靶点. 结果: RT-PCR结果显示,从A549细胞中扩增出约720 bp的片段.菌液PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49构建成功且序列正确.免疫荧光和Immunoblotting结果显示,在转染p3×Flag-CMV-14/ANKRD49的细胞中有ANKRD49的表达,蛋白质相对分子质量(Mr)约为27kDa,而转染空质粒组未见表达.MTT结果显示,ANKRD49对细胞增殖没有影响.共转染实验结果显示,1号和4号RNA干扰序列可以有效降低人ANKRD49的表达. 结论: 成功构建了真核表达重组体p3×Flag-CMV-14/ANKRD49,该蛋白质位于细胞核,不参与细胞增殖;同时鉴定出该基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究其功能奠定了基础