荧光标记复合PCR扩增微卫星位点的构建与优化

本研究采用毛细管电泳技术，构建并优化了荧光标记复合PCR同时扩增多个微卫星位点。主要过程为：首先根据设计所扩增微卫星位点的期望长度，将9个微卫星位点分成两组，5个位点用FAM（蓝色）标记，4个位点用HEX（绿色）标记；两种荧光类型分组优化，用琼脂糖胶电泳检测。其次，荧光标记的复合PCR扩增8个中华绒螯蟹样品的9个微卫星位点，采用ABI3730xl毛细管电泳检测，以ROX500（红色）为长度标准物，结果经Genemapper3.5软件 分析，检测结果表明毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物不仅精确读取微卫星位点的长度（分辨率高达1bp），还能区分微卫星位点复制时滑链所引起的“回声斑”；调整各微卫星位点引物比列使所有位点扩增强弱均匀。最后，逐一检测复合PCR基本参数（dNTP浓度、 PCR程序和模版DNA用量）对复合PCR产物的影响，优化PCR。结果表明通过毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物来读取微卫星位点的基因型具有精确性、高效性和稳定性