慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体，并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板，PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长，酶切后插入穿梭载体pENTR/U6，再应用Gateway技术，基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上，构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后，将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度；Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平；CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化；流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确；浓缩后病毒滴度较高；重组慢病毒感染HepG2细胞后，细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调，HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01），S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功，外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色