重组人多胺氧化酶的原核表达及抗体制备

目的:采用基因重组技术获得有酶活性的重组人多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）并制备兔抗人多胺氧化酶多克隆抗体。方法：采用RT-PCR 法从人非小细胞肺腺癌A549细胞株总RNA中克隆人多胺氧化酶cDNA，构建PAO原核表达质粒pET-15b/PAO并转化E.coli 的BL21（DE3）菌株。IPTG 诱导表达的重组PAO经Ni-NTA亲和层析纯化和透析复性后，化学荧光法测定酶活性。用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化的重组人PAO蛋白，皮内接种日本大耳白兔以制备多克隆抗体。以ELISA、Western Blot和免疫细胞化学法分别检测兔血清中抗体滴度和抗原特异性。结果：纯化并透析复性后的重组人PAO蛋白具备快速氧化特异性底物的酶活性。用此基因重组蛋白制备的抗体具有高抗体滴度和针对人PAO的特异性。结论：本试验建立了人PAO原核表达、纯化系统, 获得了有酶活性的高纯度人PAO蛋白并成功制备了兔抗人PAO的多克隆抗体，为以PAO为靶点的抗肿瘤基础和临床研究提供了有力的研究工具