猪髓样分化因子MyD88特异性shRNA干扰载体的构建筛选及干扰效果评价

髓样分化因子MyD88(myeloid differentiation factor 88)信号通路是一个具有多种调节功能的传导通路,在免疫反应、炎症反应及肿瘤的发生和发展过程中均发挥重要作用。构建猪(Sus scrofa)MyD88基因的shRNA干扰载体,并在转录水平和蛋白质表达水平对其干扰效果进行验证,以筛选出干扰效果最优的干扰载体。根据猪 MyD88 基因(GenBank登录号:KC766424.1)全长cDNA序列,利用Invitrogen公司在线设计软件设计出4对shRNA干扰序列,退火成双链后,分别将其插入到pYr-1.1载体中,构建 MyD88 基因的shRNA真核表达载体pYr-1.1-pigMyD88-sh1、pYr-1.1-pigMyD88-sh2、pYr-1.1-pig MyD88-sh3、pYr-1.1-pigMyD88-sh4,并通过双酶切和测序对其进行鉴定。构建成功后转染猪肺泡巨噬细胞3D4/2,通过Real-time PCR及Western blot验证 MyD88 基因的表达水平,以及对LPS刺激后炎症因子TNF-α基因表达水平的影响。结果表明,所构建的猪 MyD88 基因的特异性shRNA表达载体均可显著降低猪MyD88 mRNA和蛋白质的表达水平(P<0.05),干扰效率分别达到36%、67%、60%、69%;相比于未干扰组,LPS刺激MyD88沉默之后的巨噬细胞,炎症因子TNF-α基因表达水平显著下降(P<0.05),表明所构建猪MyD88干扰载体干扰效果较好