红色原鸡外周血单个核细胞IFN-γ的诱导表达及其荧光定量PCR检测

摘要 为建立检测红色原鸡外周血单个核细胞(PBMC)中干扰素γ(IFN-γ)mRNA表达水平的方法，通过优化刀豆蛋白A(Con A)诱导PBMC表达IFN-γ的条件，采用RT-PCR方法以3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参扩增IFN-γ基因，插入克隆载体pMD18-T分别构建重组质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH，以其作为标准品采用SYBR Green I染料法建立荧光定量PCR检测方法，并将该方法应用于34只红色原鸡PBMC IFN-γ表达量的检测。结果发现，PBMC在20 μg/mL Con A刺激培养12 -25 h 时IFN-γ处于高表达水平；标准品质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH分别在拷贝数6.72×102-6.72×109、3.94×102-3.94×109范围内与其对应的Ct值呈现良好的线性关系(R2 > 0.99)，扩增产物的熔解曲线均只有特异的单峰，表明所用引物特异性强。在优化Con A诱导红色原鸡PBMC表达IFN-γ条件的基础上，建立了可用于定量检测红色原鸡PBMC IFN-γ mRNA表达水平的荧光定量PCR方法