大黄鱼酪氨酸激酶基因克隆及原核表达分析

摘要 为了研究大黄鱼（Larimichthys crocea）T淋巴细胞酪氨酸激酶（lymphocyte cell kinase,LCK）的基因结构和功能,通过RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼LCK（LcLCK）基因cDNA 全长序列,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对该基因在大黄鱼各组织器官和胚胎发育各时期的表达情况进行了检测与分析,同时构建了LcLCK基因的原核表达载体,在大肠杆菌中进行了高效表达。结果表明,获得的LcLCK基因全长为2 334 bp,开放阅读框为1 503 bp,编码501个氨基酸。该蛋白具有非受体酪氨酸激酶Src家族典型的SH3、SH2和TyrKc三个结构域,其N端含有GCXCS和CXXC基序,C末端出现2个与人类LCK基因中的Tyr394和Tyr505相一致的保守酪氨酸位点。系统发育树表明LcLCK与红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）LCK聚为一支;LcLCK基因在雌雄大黄鱼各组织器官中均有表达,其中在主要免疫器官脾脏、头肾和鳃有高丰度表达,雌性个体的表达量要高于雄性个体;胚胎发育过程中,LcLCK基因表达水平在多细胞期、囊胚期和原肠期较高,囊胚期达到峰值,卵黄栓形成期显著降低,眼泡出现期至孵出期持续下降,而初孵仔鱼期则有所回升;构建的原核表达载体pGEX-4T-2-LCK在大肠杆菌中成功表达,其新增LcLCK重组蛋白条带在SDS-PAGE电泳检测中约为84 kD,与预期表达的分子量相符。大黄鱼LcLCK在雌雄成熟个体的细胞免疫应答以及胚胎发育过程中T淋巴细胞免疫器官的形成密切相关