利用λRed 重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

摘要 摘要：利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的（SalmonellaentericaserovartyphimuriumLT2，S.typhimuriumLT2）sopB基因。以pKD4质粒为模板，扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段，将其转化至表达Red重组酶的S.typhimuriumLT2感受态细胞中；在抗生素压力和λRed重组系统帮助下，同源片段和菌体sopB基因发生同源重组，通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌；转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记，得到保留单一FRT位点的突变菌株；利用PCR技术鉴定重组菌，并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力，且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimuriumLT2的sopB基因缺失突变株，为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具，同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索