环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测哈维氏弧菌的研究

摘要 以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)为材料，利用环介导等温扩增技术(LAMP)进行核酸扩增，借助横向流动试纸条(LFD)完成产物检测，旨在建立一种可用于哈维氏弧菌快速检测的LAMP-LFD新技术。以哈维氏弧菌的溶血素基因(vhhA)为检测靶标设计了3对特异性引物(其中，上游内引物vhhA-FIP由生物素标记)，进行由生物素标记的LAMP反应；同时设计1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针，与获得的LAMP产物进行特异性杂交，杂交产物经LFD完成检测。经优化，LAMP的反应条件为63℃反应40 min，由LFD完成结果判读共需50 min。结果表明，LAMP-LFD方法能特异性地检出哈维氏弧菌，对创伤弧菌等其他9种水产养殖重要病原菌的检测结果呈阴性。利用该方法，针对细菌纯培养物的检测灵敏度为1.0×102 CFU/mL或2 CFU/反应，针对污染有该菌的大黄鱼组织的检测灵敏度为5×102 CFU/mL或20 CFU/反应，均是以LAMP外引物vhhA-F3/vhhA-B3的常规PCR方法的100倍。因此，该方法能够快速、准确地检出哈维氏弧菌，有望在海水养殖过程哈维氏弧菌的监测和即时检测中普及使用