靶向钠钾ATP酶α1亚单位shRNA质粒表达载体的构建与筛选

摘要 构建编码人钠钾ATP酶(Na+/K+-ATPase)α1mRNA的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体shRNA-ATP1A1(ATP1A11、ATP1A12和ATP1A13),并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。设计、合成靶向ATP1A1的3对DNA序列,分别插入Pgenesil-3中构建3个shRNA表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定确认。筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞荧光检测Na+/K+-ATPaseα1表达变化;MTT法和流式细胞术检测沉默效果最明显的ATP1A13对HepG2增殖活性和细胞周期的影响。构建的质粒表达载体酶切鉴定均可扩增出预期条带,测序符合设计要求,构建成功。ATP1A12和ATP1A13对所转染的HepG2细胞中Na+/K+-ATPaseα1mR-NA和蛋白质表达均有抑制作用,其中ATP1A13最为明显(P<0.05)。ATP1A13可抑制HepG2细胞的增殖;转染48和60h,HepG2细胞细胞周期呈现S期阻滞;实时定量PCR检测ATP1A13敲低HepG2Na+/K+-ATPaseα1mRNA呈时间依赖性,72h后表达降低约90%。试验成功构建靶向钠钾ATP酶α1亚单位的shRNA质粒表达载体,其中shRNA-ATP1A13可显着抑制HepG2细胞增殖引起细胞周期S期阻滞