改良重叠区扩增法构建Rac1相关质粒

摘要 采用改良重叠区扩增法实现Rac1基因定点突变, 构建人Rac1基因相关真核表达质粒, 观察EGFP-Rac1融合蛋白在人正常肝细胞LO2中的表达。利用RT-PCR的方法得到Rac1基因, 使用改良重叠区扩增法实现Rac1基因的定点突变, 获得Rac1突变基因。将Rac1基因及Rac1突变基因通过限制性酶切技术及DNA连接技术插入真核表达载体pEGFP-C1中, 获得重组质粒pEGFP-C1-Rac1, pEGFP-C1-Rac1V12和pEGFP-C1-Rac1N17。将上述质粒瞬时转染入LO2细胞中, 采用荧光技术及Western blotting检测目的基因的表达。结果显示, 限制性酶切及基因测序证实质粒构建正确, 转染LO2细胞后, 融合蛋白EGFP-Rac1在细胞中高效表达。成功构建真核表达质粒, 在LO2细胞中, 该质粒能成功表达融合蛋白EGFP-Rac1