前手性酮全细胞转化体系中甲酸脱氢酶C-端无序结构与转化效率的关系研究

目的: 构建前手性酮类化合物的重组全细胞催化体系,并研究CbFDH C-端无序的11个氨基酸与酶活性的关系。方法:利用基因工程方法构建野生型LbADH ,CbFDH及C-端11个氨基酸缺失的CbFDH截短突变体的表达菌株;SDS-PAGE分析其表达方式及表达量,利用分光光度计法测定全菌破碎上清中的酶活性;将含野生型LbADH及CbFDHΔ354-364的菌株与底物混合孵育,考察双菌全细胞体系的催化效果;并将含野生型CbFDH及CbFDHΔ的菌液分别与含野生型LbADH的菌株混合催化苯乙酮的转化,比较两种菌的协助转化效率。结果: 构建了重组表达载体pETDuet-1-adh,pETDuet-1-fdh及pETDuet-1-fdhΔ354-364,并实现了在大肠杆菌中的异源表达,含野生型LbADH 及CbFDH的两种菌株能够实现苯乙酮的协同转化,转化率为24.4%,产物对映体纯度为96.79% ;CbFDH及CbFDHΔ354-364分别占上清总蛋白的28.54%及37.72%,C-端的缺失未影响CbFDH的可溶性表达,但CbFDHΔ354-364全菌上清催化NAD+转化为还原型NADH的效率降低,为CbFDH粗酶液的29.82%;且重组菌株Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdhΔ354-364与Rossetta(DE3)-pETDuet-1-adh协同转化苯乙酮的转化率降低至8%。结论: 重组菌株Rossetta(DE3)-pETDuet-1-adh与Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdh能够协同催化苯乙酮转化,转化效率为24.4%,产物对映体纯度为96.79%;重组菌株Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdhΔ354-364与Rossetta(DE3)-pETDuet-1-adh协同转化苯乙酮的效率为Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdh与Rossetta(DE3)-pETDuet-1-adh协同转化效率的32.79%,且Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdhΔ354-364全菌上清催化还原型辅酶再生的效率降低,提示C-端无序的11个氨基酸残基对CbFDH酶活性的发挥起着重要的作用