实时定量PCR检测外科发热患者静脉血中大肠杆菌DNA的方法

摘要 目的 建立实时定量PCR(RQ-PCR)检测大肠杆菌DNA的方法,评估临床标本检测效果.方法选择大肠杆菌β-右旋半乳糖苷酶基因作为检测靶基因设计引物和探针,采用High Pure PCR Template Preparation Kit提取基因组DNA,建立20μl TaqMan探针RQ-PCR反应体系.对26份外科发热患者标本(血标本20份,腹腔引流液3份,胸水2份,胆汁1份)进行荧光RQ-PCR检测.结果引物和探针特异性好,标准曲线相关系数在0.991～0.999之间.在最低检测限(102拷贝/反应体系)以上,仪器对不同含量大肠杆菌样本检测的平均准确性为(112.19±7.48)%;批内及批间重复性平均变异系数(CV)分别为(16.33±4.80)%和(16.03±7.80)%.血标本中大肠杆菌DNA平均提取效率为(38.40±14.05)%,提取效率平均CV为(20.57±16.92)%.含有同等量大肠杆菌模拟标本存放在-20℃或-70℃6个月内,大肠杆菌DNA拷贝数差异无显著性(P=0.130).外科发热患者血中大肠杆菌阳性率高达30%,最高含量约为1.24×106个/ml;另外在胆汁及腹腔引流液标本中检测出的大肠杆菌DNA含量明显高于相同患者血中含量.结论RQ-PCR是一种快速、灵敏、特异、重复性好、能定量起始模板拷贝数的检测大肠杆菌DNA方法,可用于定量检测全血及其他体液标本中大肠杆菌含量