一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法. 方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列, 应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针, 对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化, 验证方法的特异性、敏感性和重复性. 并通过对蚊虫样本的检测, 以评价该方法的实际应用价值. 结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0. 1 μmol/L探针浓度, 0. 2μmol/L引物浓度, 5 mmol/L Mg2+浓度. 结果表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性, 对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应, 检测的灵敏度达0. 1 TCID50, 重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次, 其标准差均在合理范围内, 分别为0. 033、0. 079、0. 149和0. 411. 对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测, 结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性, 而病毒分离则只检测出3份阳性, 表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感, 可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸, 从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右, 且操作简便、敏感性高. 结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点, 适用于乙脑病原学的快速检测