应用Taqman实时PCR法检测禽肉中沙门菌的研究

目的 建立敏感快速的检测禽肉中沙门菌的实时PCR法。 方法 以 invA 基因为基础，建立RT–PCR法并验证其特异性。选用肠炎沙门菌CMCC 50041，制备不同浓度的纯菌液，用RT–PCR进行检测，制作标准曲线并计算扩增效率。进行人工染菌实验，染菌量分别为每25 g鸡肉样本1、10、10 2、10 3、10 4、10 5和10 6 CFU。分别在增菌0、4、8、12、18 h取1 ml培养液，提取DNA进行RT–PCR检测，并同时用PCR和传统方法进行检测，比较3种方法检测的敏感性和特异性。采集16份市售整鸡样本，用这3种方法进行检测，进一步比较三者的阳性检出情况。 结果 建立的RT–PCR法特异性好，对纯菌液的最低检测限为5.2×10 3 CFU/ml，在5.2×10 3～5.2×10 10 CFU/ml范围内，菌浓度的对数值和检测结果的Ct值线性关系良好， R 2＝0.999。人工染菌样本在增菌12 h后，RT–PCR法检出限可达1 CFU/25 g，与PCR检测的敏感性一致，比传统方法的检出限敏感10倍。根据增菌12 h的检测结果，建立了RT–PCR样本标准曲线。采用RT–PCR检测16份禽肉样本，检出7份阳性，与PCR一致，高于传统方法(5份阳性)。根据样本标准曲线，对检测样本进行定量分析，确定了阳性样本中初始含量菌。 结论 所建立的RT–PCR具有快速简便、敏感特异等优点，适用于禽肉中沙门菌的快速定量检测