海产品中霍乱弧菌免疫磁分离和实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的 采用纳米免疫磁珠(Nano–IMS)分离霍乱弧菌，建立霍乱弧菌实时荧光PCR(Real–time PCR)检测方法。 方法 采用霍乱弧菌单克隆抗体，制备霍乱弧菌纳米免疫磁珠(Nano–IMB–Vc)，特异性吸附霍乱弧菌，结合Real–time PCR技术，建立霍乱弧菌快速检测方法。选用15株典型菌株，对Nano–IMB–Vc捕获特异性进行验证；选取102株霍乱弧菌和101株非目标菌，对所建立的Real–time PCR方法进行特异性验证；采用纯菌的灵敏度检测和基质添加实验对所建立方法的灵敏度进行检测，并与食品中霍乱弧菌的检测方法(NMKL No.156)进行比较。 结果 Nano–IMB–Vc在菌体浓度为10 3 CFU/ml水平，对霍乱弧菌的捕获率最高可达70.2%。Nano–IMB–Vc分离结合Real–time PCR技术，在纯培养、无需增菌情况下，检测灵敏度达到5.4×10 2 CFU/ml；通过102株霍乱弧菌和101株非目标菌的测试，102株霍乱弧菌检测结果均为阳性，其余101株非目标菌检测结果均为阴性，无交叉反应。采用Nano–IMB–Vc分离结合Real–time PCR技术，在食品基质添加试验中，每25 g样品中添加1 CFU霍乱弧菌，增菌8 h即可检出。 结论 Nano–IMB–Vc分离结合Real–time PCR技术，具有良好的特异性，较高的检测灵敏度，适用于霍乱弧菌的快速筛选