纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子的多重PCR鉴定

为建立纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子快速鉴定的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法，根据芽孢杆菌的芽孢形成早期因子基因spo0A和13 株乳酸菌β-半乳糖苷酶基因的保守序列分别设计引物对P1/P2和P3/P4，以亲本菌株DNA为模板，优化每对引物在适宜退火温度条件下的PCR体系，在最优体系下的特异性分析结果表明P1/P2能特异性扩增出spo0A基因片段（308 bp），而7 株乳酸菌全部呈阴性；P3/P4可扩增出所有受试乳酸菌和经表型鉴定确定的阳性融合子中的目标基因片段（576 bp），而对芽孢杆菌无扩增。多重PCR结果表明在P1/P2的最优体系中只有308 bp片段的扩增，而在P3/P4的最优体系中可实现2 个片段的共扩增，对融合后获得的50 个菌株的鉴定结果与单重PCR和表型鉴定结果100%吻合。该体系中模板DNA 1 ng/μL，每条引物0.4 μmol/L，脱氧核糖核苷三磷酸0.25 mmol/L，Taq酶0.06 U/μL；PCR时94 ℃预变性5 min；每个循环（共30 个）94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，产物末端 72 ℃延伸7 min。该方法简便、快速、特异性好，适用于芽孢杆菌、乳酸菌以及二者融合子的快速鉴定