酿酒酵母和大肠杆菌鸟嘌呤脱氨酶基因的克隆、原核表达及活性测定

与植物体内合成路径不同，微生物体内合成咖啡碱存在一条以黄嘌呤为底物，利用鸟嘌呤脱氨酶催化鸟嘌呤生成黄嘌呤有效合成咖啡碱的新途径。为克隆鸟嘌呤脱氨酶的基因，构建可高效合成黄嘌呤的原核表达载体并对外源蛋白活性进行检测，分别以酿酒酵母和大肠杆菌为研究材料，根据GenBank中酿酒酵母和大肠杆菌中鸟嘌呤脱氨酶基因gud1和egud序列设计引物，聚合酶链式反应特异扩增其基因片段，将目的基因连接至pMAL-c5X载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）中诱导蛋白表达，并用高效液相色谱法鉴定其目的蛋白的催化活性。结果表明重组载体pMAL-gud1、pMAL-egud均可用来合成黄嘌呤，且GUD1比EGUD合成黄嘌呤的效率更高。研究结果将进一步丰富黑茶加工技术理论，同时为体外构建高效咖啡碱生物工程菌提供理论支持