福建道地药材枇杷叶ISSR反应体系的建立与优化

目的 建立适于福建产枇杷叶的ISSR分析的PCR反应体系，筛选适宜引物，并确定最佳退火温度。方法 改良的CTAB法提取嫩叶中DNA，通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件，利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果 适于枇杷叶ISSR最佳的反应体系为：总反应体积为25 μL，其中模板DNA 60 ng，Taq DNA聚合酶0.9 U，引物浓度0.4 μmol?L-1，dNTP浓度200 μmol?L-1，10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL，加入灭菌去离子水至25 μL。扩增程序为：预变性94 ℃ 7 min，变性94 ℃ l min，复性最佳退火温度1 min，延伸72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。在100条引物中筛选出14条扩增条带清晰且条带数目较多的引物，最佳退火温度为48~58 ℃(因引物不同而异)。 结论 建立了枇杷叶ISSR最佳反应体系，筛选出14条引物并确定了最佳退火温度，为应用ISSR技术鉴定枇杷叶的种质资源和遗传多样性研究奠定了基础