利用正交设计优化小苍兰ISSR-PCR反应体系

摘要： 通过L16(45)正交试验，研究了镁离子浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响，建立了适合于小苍兰ISSR-PCR的反应体系。优化体系为：25 μL PCR反应体系中含有1×Taq酶缓冲液(10 mmol·L-1 KCl，8 mmol·L-1(NH4)2SO4，10 mmol·L-1 Tris·HCl，pH 9.0，0.05% NP-40)，2 mmol·L-1 MgCl2，0.06 U·μL-1 Taq酶，0.4 μmol·L-1引物，4.0 ng·μL-1模板DNA，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.6 mmol·L-1。利用温度梯度PCR，确定了最适宜的退火温度为51.5℃。该优化体系的建立为下一步对小苍兰进行ISSR分子标记奠定了基础