N-端缺失突变核糖核酸酶抑制因子在毕赤酵母中的克隆与表达

人胎盘核糖核酸酶抑制因子(HRI)是一种存在于细胞浆中的50kDa的酸性蛋白质,富含亮氨酸和半胱氨酸.作为胞浆蛋白可保护细胞不受外来的胰RNase的侵袭,同时做为RNase抑制剂在各实验室广为应用.HRI主要结构是由7个富含亮氨酸的重复序列组成,7个亮氨酸重复单位有规律环状排列使N-末端、C-末端在空间上较为接近.本文用PCR的方法在HRI cDNA 5'端去除30个碱基,并将此缺失突变的HRI的cDNA片段构建于质粒pPIC9K,PCR和双酶切鉴定结果为阳性,测序结果证实在HRI cDNA 5'端成功引入30个碱基的缺失突变.电击转化入毕赤酵母(Pichia pastores)GS115中,进行分泌型表达.对表达产物进行亲和层析纯化.经SDS-PAGE和Western-blot免疫印迹杂交,证实表达产物为N-端缺失突变的核糖核酸酶抑制因子