猪VIII 因子A1和A3结构域对翻译后剪接的人/ 猪杂合VIII 因子的促分泌作用

凝血VIII 因子(fVIII)蛋白的低效分泌以及基因过大是基于转fVIII 基因的甲型血友病基因治疗的不利因素。本室前期用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接实验证明，运用双载体共转fVIII 基因，通过翻译后蛋白质剪接，轻链可顺式促进fVIII蛋白的分泌。本文用猪fVIII 蛋白的A1 和A3 结构域替换人fVIII 蛋白相应的结构，构建人/ 猪杂合fVIII (human/porcine hybridfVIII, HP-fVIII)，研究基于内含肽的双载体转HP-fVIII 基因后剪接HP-fVIII 的分泌和活性。构建一对分别融合Ssp DnaB内含肽的HP-fVIII 重链和轻链基因表达质粒，瞬时共转染COS-7 细胞，用ELISA 和Coatest 法定量分析分泌至培养上清中HP-fVIII 的剪接和生物活性，用Western blotting 检测了细胞内HP-fVIII 的剪接。结果显示，双载体转HP-fVIII 基因细胞上清的剪接HP-fVIII 蛋白量为(184±34) ng/mL，活性为(1.18±0.22) IU/mL，明显高于双载体转人fVIII 基因[蛋白量为(48±12)ng/mL，活性为(0.31±0.10) IU/mL]，提示猪fVIII 的A1 和A3 结构域能显著促进内含肽剪接的HP-fVIII 的分泌和活性；另外，还在混合培养的分别转内含肽融合HP-fVIII 重链和轻链基因细胞上清中检测到剪接的HP-fVIII 蛋白量为(27±5) ng/mL，活性为(0.19±0.07) IU/mL，提示内含肽对HP-fVIII 的剪接可不依赖细胞机制，分泌出胞的前体蛋白仍可进行剪接反应；双载体转HP-fVIII 基因细胞内检测到与转hfVIII 基因阳性对照细胞内hfVIII 条带大小接近的剪接HP-fVIII 蛋白条带，进一步证实HP-fVIII 的剪接。该结果为进一步在动物体内应用内含肽的双腺相关病毒载体转HP-fVIII 基因奠定了实验基础。