川芎嗪-黄芪甲苷降低缺血/再灌注损伤的大鼠脑组织中IL-1β和Caspase-3基因的表达：实时定量PCR的研究

本文旨在运用实时荧光PCR技术建立大鼠脑缺血/再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)中IL-1β和Caspase-3基因绝对定量分析方法。成年雄性Sprague-Dawely大鼠被随机分成了5组：假手术组、I/R模型组、黄芪甲苷组、川芎嗪-黄芪甲苷组、尼莫地平组。除假手术组外，其余各组均进行脑I/R处理，然后通过腹膜内注射进行药物处理，时间为脑I/R后0 h、12 h、1 d、2 d直至7 d。假手术组和I/R模型组注射生理盐水(5 mL/kg)，黄芪甲苷组中黄芪甲苷剂量为20 mg/kg，川芎嗪-黄芪甲苷组中川芎嗪和黄芪甲苷剂量分别为10 mg/kg和20 mg/kg，而尼莫地平组中尼莫地平剂量为10 mg/kg。通过常规RT-PCR克隆了大鼠的IL-1β和Caspase-3基因，运用TA克隆技术分别构建了重组质粒pTA2-IL1和pTA2-Casp3，重组质粒经过紫外分光光度计测定A260/A280比值，并计算拷贝数。以该质粒作为标准品，首先对实时荧光PCR反应的引物进行筛选和验证，然后进行反应退火温度的优化，最后定量检测各组损伤的脑组织中IL-1β和Caspase-3的基因表达情况。结果显示，从候选引物中各筛选到一对最佳引物，熔解度曲线分析显示单一峰，琼脂糖电泳表明反应产物与预计目标产物大小一致。梯度退火温度实验表明IL-1β和Caspase-3基因的最佳退火温度分别是59 °C和61.2 °C。实时荧光PCR检测结果表明，与假手术组相比，I/R模型组中的IL-1β和Caspase-3表达显著升高；和I/R模型组相比，黄芪甲苷组、川芎嗪-黄芪甲苷组、尼莫地平组中IL-1β和Caspase-3基因表达水平均有所下降，特别是川芎嗪-黄芪甲苷组基因下调最显著。以上这些结果提示，本研究建立的方法适用于中药处理I/R模型后IL-1β和Caspase-3基因的定量分析。