文昌鱼BRA蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

Brachyury编码的转录调控因子BRA参与脊索动物脊索的分化形成，文昌鱼是最早具有真正脊索的后生动物类群，因此开展文昌鱼Brachyury基因功能研究，将有助于揭示脊索的起源与进化。文昌鱼具有2个Brachyury基因：Bra1和Bra2，二者编码的蛋白序列相似度高达93%，缺少有效区分二者的特异抗原表位，转录组数据分析表明Bra2表达量显著高于Bra1，进一步对BRA2蛋白序列特征分析发现其N端拥有丰富的潜在抗原决定簇，因此本研究选择了Bra2 N端696 bp基因序列所编码的蛋白片段作为制备抗体的抗原蛋白。将该段基因序列克隆重组入pET28a原核表达质粒，经诱导表达获分子量约31 ku的可溶性重组蛋白。通过Ni2+亲和层析柱纯化，得到1.3 g/L高纯度抗原蛋白，用3只ICR小鼠（Mus musculus）经4轮重组蛋白免疫 [剂量50 μg/（只?次）]后获得最高效价（1︰256 000）的多克隆抗体。Western印迹结果显示，本研究制备的鼠抗文昌鱼BRA多克隆抗体不仅可特异识别重组抗原蛋白，也可高效识别文昌鱼胚胎总蛋白中的BRA1和BRA2，为后续深入研究文昌鱼BRA在脊索发育调控中的作用提供了有力的分子工具