禽类多瘤病毒APV-1晚期基因多顺反子的EGFP标记载体构建和表达

为研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的机制，设计和构建了以增强绿色荧光蛋白(EGFP) 报告基因替代病毒 APV-1 野生型的晚期结构蛋白 VPs 基因的真核双顺反子表达载体，并观察其在转染进入禽类原代 成纤维细胞中的表达翻译状态．以APV-1 的cDNA 克隆(pHL1003) 为模板，运用PCR 技术扩增出与野生型病毒APV-1 相同的 Ori 区、早期编码区和晚期 Agno-1a 区序列作为载体片段;从质粒 pEGFP-N1 中扩增出编码绿色荧光的 EGFP DNA 片段;经连接构成重组质粒 pHL1003-GFP，通过脂质体细胞转染方法将质粒 DNA 转染到鸡胚胎和鹌鹑胚胎成纤 维细胞中，通过细胞培养观察荧光表达状况． DNA 序列分析证实了重组克隆中的EGFP 序列与已知的质粒pEGFP-N1 中 EGFP 序列一致．转染72 h 后观察鸡和鹌鹑胚胎成纤维细胞，转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光，说明 GFP 可 以在构建的双顺反子重组质粒的下游中正常表达并产生荧光． pHL1003-GFP 重组质粒的构建及其在禽类原代成纤维 细胞中的高效表达，为我们研究多顺反子翻译起始调控中Agno-1a 基因的表达对下游病毒结构蛋白基因的翻译调控 机制提供了简洁易用的系统和模型