活性污泥中的腐殖酸对实时荧光定量PCR的影响

活性污泥基因组中的腐殖酸会影响实时荧光定量PCR检测的准确性.本研究采用抽提基因组前腐殖酸去除试剂盒、抽提基因组后腐殖酸去除试剂盒、抽提基因组前后共同去除试剂盒3种不同的方法，去除活性污泥基因组中的腐殖酸，经过PCR和实时荧光定量PCR方法的验证找出腐殖酸去除的最适方法；通过DNA酶Ⅰ消化基因组DNA保留杂质腐殖酸，向其中掺入已知浓度的总细菌质粒，5个浓度10倍梯度稀释10 ng·μL-1的定量模板，探究腐殖酸和梯度稀释模板对活性污泥总细菌实时荧光定量PCR的影响.结果显示，在不同处理组中，通过反复洗脱的方式在基因组抽提前去除活性污泥中的腐殖酸，DNA的得率（162.46 ng·μL-1）最多，A260/230值为1.34，A260/280值为1.80，腐殖酸的残留最少；去除腐殖酸后外加内标质粒组，梯度稀释10 ng·μL-1模板100倍及以上，腐殖酸的抑制效应显著降低后保持不变（p<0.05），100倍以内变化不显著（p>0.05）；抽提前去除腐殖酸组进行实时荧光定量PCR的抑制效率为6.16%，显著低于对照组的72.68%（p<0.05）.研究表明，抽提前去除活性污泥腐殖酸，抽提后将基因组模板稀释100倍可显著降低活性污泥实时荧光定量PCR的抑制效率，提高定量结果的准确性