嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶生物学活性的分子特征分析

已知Pif1解旋酶在维持基因组稳定性方面发挥重要作用，且不同生物Pif1解旋酶具有不同的生物学活性；然而迄今为止，嗜热细菌Pif1解旋酶的生物学活性分子特征的研究尚未见报道。本文运用生物化学与生物物理学前沿技术，系统地研究了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶（Defe.Pif1）结合活性与解旋活性的分子特征。通过原核表达纯化系统，本研究获得纯度95%以上、无标签的Defe.Pif1蛋白。利用荧光偏振技术研究Defe.Pif1结合反应的底物特异性，揭示出Defe.Pif1优先结合ssDNA与G4 DNA，并对含3′-尾链的部分双链底物有较强亲和力，其结合反应底物特异性为：ssDNA > G4 DNA > 3′-ssDNA-dsDNA≈Y-structure > Other substrates。通过快速停留检测技术研究Defe.Pif1的解旋活性，明确其最适解旋温度为50℃，最佳反应溶液为10 mmol/L NaCl、3 mmol/L DTT、3 mmol/L MgCl2及1 mmol/L ATP；进一步的解旋动力学特征分析结果显示，Defe.Pif1可以高效解旋含G4结构的DNA底物，其解旋5′-G4dsDNA底物时的解旋幅度超过90%，解旋速率也与其解旋5′-ss-dsDNA底物的速率相近，提示Defe.Pif1解旋G4 DNA更接近Bs.Pif1的单体反应模式。此外，本研究还发现Defe.Pif1解旋不同类型复制叉/复制泡底物时拥有独特的解旋倾向性：与解旋其它复制中间体DNA的低效性不同，Defe.Pif1解旋12ntbubble底物的速率与幅度均较高，暗示12ntbubble结构很可能是该解旋酶复制中间体的天然底物。上述结果证明，Defe.Pif1不仅具有Pif1解旋酶家族成员共同的结合与解旋G4 DNA等活性特征；而且作为嗜热细菌的解旋酶，它还具有独特的反应条件与解旋底物特异性。本研究为研究Pif1解旋酶家族其它成员的分子特征与生物功能提供了潜在的研究策略，为阐明此类Pif1解旋酶的分子作用机制奠定实验基础