奶山羊EGFR蛋白胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列)，纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体，为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板，采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区（ECD）基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体，将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。通过Ni-Charged MagBeads纯化重组蛋白后免疫2月龄白色獭兔，采用间接ELISA (iELISA)法测定抗体效价，Western blot 检测抗体特异性。【结果】PCR扩增得到1 860 bp的EGFR胞外区基因序列，成功构建pET-32a(+)-ECD载体。加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG，于37 ℃诱导表达6 h成功得到重组蛋白，该蛋白分子质量约94 ku，且为以包涵体形式存在的变性蛋白。iELISA检测抗体效价为1∶16 000；Western blot检测表明，制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的ECD蛋白及在山羊乳腺上皮细胞和HEK293细胞中的EGFR蛋白。【结论】成功制备山羊EGFR多克隆抗体，该抗体可以用于科研试验