山黧豆CASase基因DNA全长序列的扩增及CRISPR/Cas9敲除载体的构建

【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因（CASase）DNA全长序列，构建CRISPR/Cas9敲除载体，为筛选“低毒、高硫”山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4 d山黧豆幼苗根部为材料，提取其基因组DNA，利用PCR克隆CASase基因全长；经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后，在CASase cDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测；从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA，利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r、pPLHACas9-sgRNA68r、pPLHACas9-sgRNA225f和 pPLHACas9-sgRNA256f。【结果】 获得了CASase基因3 143 bp的DNA全长序列，该序列编码β-腈基丙氨酸合成酶；在CASase cDNA中选取5个sgRNA靶位点在体外均能有效剪切靶序列；菌落PCR检测结果显示，4个CRISPR/Cas9基因敲除载体构建成功。【结论】克隆了山黧豆CASase基因DNA全长，成功构建了该基因上4个sgRNA靶位点的CRISPR/Cas9敲除载体