猪囊尾蚴API基因原核表达条件的优化

【目的】获得猪囊尾蚴凋亡蛋白酶抑制剂（API）基因在大肠杆菌中的最佳表达条件，为API功能研究奠定基础。【方法】以表达载体pEGX-4T-1、pET-30a及猪囊尾蚴API基因的原核表达载体pEGX-4T-1/API-Flag、pET-30a/API为材料，对影响API蛋白表达的载体（pEGX-4T-1、pET-30a）、温度（25，30，37 ℃）、诱导时间（2，4，6，8 h）、IPTG终浓度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L）和卡那霉素终浓度（100，200，300，400 mmol/L）等条件进行优化，筛选重组蛋白最佳的表达条件。对在最佳条件下获取的目的蛋白进行超声处理，4 ℃、10 000 r/min离心分别收集上清液和沉淀，对目的蛋白进行可溶性分析；SDS-PAGE后，将目的蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上，与抗His标签抗体共孵育，检测目的蛋白的反应原性。【结果】 当选择pET系列载体（pET 30a）时，API表达量高于其在pGEX系列（pGEX-4T-1）中的表达量。API融合蛋白最佳表达条件为：在含200 mmol/L卡那霉素的LB培养基上于37 ℃培养3 h后，加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG，再于30 ℃诱导培养6 h。SDS-PAGE结果表明，pET-30a/API融合蛋白分子质量约为53 ku，与预期蛋白分子质量一致。Western blot检测结果显示，重组蛋白pET 30a/API能够识别特异性抗体，显示获得了大量表达正确的目的蛋白。【结论】 确定了API基因的最佳表达条件，获得了较大表达量的API融合蛋白