沼泽型水牛VASA基因启动子的克隆及转录活性检测

【目的】克隆沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列，对启动子进行生物信息学分析及转录活性检测，为后续水牛繁殖性能的分子机理研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的河流型水牛（Bubalus bubalis）的VASA 5′ 侧翼序列，经过同源比对，设计PCR引物。以沼泽型水牛血液基因组为模板扩增VASA基因5′ 侧翼序列并进行测序和生物信息学分析。将扩增的VASA基因5′ 侧翼片段插入pEGFP-1多克隆位点处，构建pVASA-EGFP-1载体。载体经脂质体转染HEK-293T和CHO细胞系，分析其转录活性。【结果】成功克隆沼泽型水牛VASA 5′侧翼序列及部分CDS区序列，共3 081 bp，同源性分析表明，沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、小鼠和人的相似性分别为99%，96%，93%，95%，90%和79%。对其5′侧翼序列2 000 bp进行启动子预测及转录因子结合位点预测，发现在其翻译起始位点上游－635-－586处存在TATA box，启动子区存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Gata3、Smad2、Smad3和Smad4等反式作用因子结合位点，其中Stat家族基因在VASA启动子区存在多个结合位点，且同一位点又存在多个Stats基因结合的情况。水牛VASA启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞中的表达，但非常微弱；能启动EGFP在CHO细胞中表达，且启动活性与CMV启动子相似。【结论】成功克隆了沼泽型水牛VASA基因启动子，分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性和转录活性