拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC进行大肠杆菌原核表达和纯化，并免疫家兔，获得针对PAC蛋白的多克隆特异性抗体，为进一步研究PAC蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥PAC蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28a中，转化BL21(DE3) 表达菌，经IPTG诱导后，对诱导产生的 PAC蛋白进行镍柱亲和纯化和SDS-PAGE割胶纯化，并将纯化的PAC蛋白通过皮下注射免疫家兔，利用分离得到的抗血清，针对拟南芥野生型、PAC敲除突变系pac-1和PAC过表达系PACOE的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因PAC的原核表达载体pET-28a-PAC，在37 ℃、1 mmol/L IPTG诱导4 h的大肠杆菌细胞中，可检测到分子质量为38.9 ku的重组蛋白，其大部分以可溶形式存在。用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得PAC抗血清，该抗血清能够有效地检测出1 ng原核表达的PAC重组蛋白，并在植物样品中检测出1条分子质量约为35 ku的条带。【结论】成功制备了PAC蛋白的多克隆抗体，可用于植物中PAC蛋白含量的检测