假单胞菌HS-D36偏苯三酚1， 2-双加氧酶克隆表达与催化特性研究

由pnpC编码的偏苯三酚1,2-双加氧酶(Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase，PnpC)是微生物分解硝基芳香族类环境污染物的关键酶.本研究从对硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP)降解菌HS-D38(Pseudomonas sp.)中克隆pnpC基因，利用E.coli BL21(DE3)高效表达重组PnpC，通过亲和色谱纯化并分析其催化特性.实验结果表明：HS-D36的pnpC开放阅读框长度为873 bp，编码290个氨基酸，酶蛋白相对分子量33 KD；20℃、异丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导可高效表达重组PnpC；重组酶经Ni-NTA亲和色谱一步分离可达到电泳纯；纯酶比活力9.3 U/mg，纯化倍数37.2，活力收率23.8%；重组PnpC催化邻苯二酚开环反应的最适温度45℃、最适pH 5.0；Lineweaver-Burk双倒数作图表明PnpC对邻苯二酚降解的米氏常数(Km)为21.95 mol/L、最大反应速度(Vmax)为2.68 mol/(min·mg)；Fe3＋、Cu2＋、Fe2＋和Zn2＋对该酶具激活作用，Ni2＋则显示抑制效应.